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dc.contributor.author
Baumschlager, Armin
dc.contributor.supervisor
Khammash, Mustafa Hani
dc.contributor.supervisor
Di Ventura, Barbara
dc.contributor.supervisor
Panke, Sven
dc.date.accessioned
2021-03-30T06:58:23Z
dc.date.available
2021-03-29T20:19:34Z
dc.date.available
2021-03-30T06:58:23Z
dc.date.issued
2020
dc.identifier.uri
http://hdl.handle.net/20.500.11850/476866
dc.identifier.doi
10.3929/ethz-b-000476866
dc.description.abstract
Precise regulation of cells and specific cellular functions is crucial for deciphering the foundations of life. It sets the ground for advanced biosystems used in biotechnological production processes or future therapeutic applications. The use of light as a control input was recognized as a highly promising communication channel to cells to achieve such precise regulation, due to the resolution in space and time it can be applied with. For example, it enables experimenters to target and induce optogenetic regulation in individual cells within a population or layer of cells. The ease of applying and removing light inputs enables computercontrolled cells using so-called in silico feedback control strategies to steer measurable outputs to predefined values. Light-inducible regulators provide the basis of this communication channel as they transform light signals containing the information into a cellular response. The work of this thesis describes the de novo development and optimization of optogenetic systems in the bacterium Escherichia coli. Although developed in E. coli, some of the regulators and methods are also applicable for other organisms. The first transcriptional regulator developed in this work is based on the DNA-dependent RNA polymerase of bacteriophage T7 (chapter 2). We have implemented light-control into the polymerase by fusing nonfunctional split fragments of the protein to blue light-inducible heterodimerization domains, creating a set of transcriptional regulators called “Opto- T7RNAPs”, which show a high dynamic range of dark to light-induced gene expression, provide excellent tunability via the light intensity and the expression level of the optogenetic regulators itself and enable highly dynamic temporal gene expression patterns. Further, Opto- T7RNAPs are orthogonal to the cellular transcription machinery. We then selected one of these newly developed gene expression systems and tuned the properties of its photosensor through directed evolution. Photosensory domains like the “Magnet domains” used in Opto-T7RNAP heterodimerize upon light-induction which functionally reconstitutes the split-enzyme. Our implementation of these photosensors directly transform the dimerization of the light-inducible domain into a fluorescent output. This direct genotype-phenotype linkage served as an excellent screening platform which allowed us to identify several new variants of the photosensor with increased light sensitivity and light-induced dimerization properties (chapter 3). Further, we hypothesized that certain classical small molecule-induced gene expression systems, which have been used for decades to “communicate with cells”, might hold the potential for implementing light-control into biological systems. This hypothesis was based on the thought that absorption of electromagnetic waves not only induces structural changes in light-inducible proteins, but can also lead to transformation and modification of chemicals which contain light absorbing moieties. Such light-induced transformation of chemicals was known for detoxification of molecules, for example tetracycline antibiotics in wastewater. We built up on these detoxification approaches to develop a method for light-dependent inactivation of the transcriptional inducer anhydrotetracycline (aTc) to enable light-control of gene expression, as well as the bacteriostatic antibiotic tetracycline for growth control using light (chapter 4). This method relies on the light-sensitivity of both of these molecules and we were able to show that functional inactivation with UVA light can indeed be precisely controlled to reduce or completely inactivate the function of these molecules. One of the main practical advantages of this method of light-mediated aTc inactivation is that it can be applied to any cells using the TetR repressor protein, or derivatives of it which respond to the inducer molecule aTc. This means that the method can be used on existing cell strains and circuits and enable optogenetic experiments without the necessity for further genetic manipulation. In addition, this method enables one to increase or decrease the setpoint for gene expression via addition of the inducer molecule and its light-mediated inactivation. This feature of “singleinput setpoint control” is unique compared to other approaches for light-control of cells which are either only activatable such as photoactivatable molecules, or eventually revert to an inactive dark state when the light stimulus is removed as seen for photosensitive proteins. We showed applications of this method for dynamic setpoint control in which we varied the setpoint of expression of a gene multiple times. Next, we combined one of our Opto-T7RNAPs with aTc-mediated repression of the Opto-T7RNAP components to implement dualoptogenetic control which reduced the dark state of the Opto-T7RNAP while the light-induced state was not changed, thus also increasing the fold-change. Further, as a proof of principle that this approach is not just limited to the molecule aTc, but can also be applied to other lightsensitive molecules, we used tetracycline to first inhibit cell growth and then enable growth again via light-mediated inactivation of the antibiotic. We also combined TetR, which allows for gene expression in the presence of aTc, with an engineered TetR variant called rTetR, which shows reversed functionality to create a chemical bandpass filter and expand the usability of aTc as an inducer and with this also our method of its light-mediated inactivation. Finally, we engineered the first endogenous light-inducible transcriptional activator in E. coli (chapter 5). As the basis of this, we used the DNA-binding and activation domain of the endogenous transcription factor AraC and combined it with light-inducible homodimerization domains to enable blue light-inducible AraC dimerization (BLADE). We showed that both conformations with the AraC domain either at the N- or the C-terminus of the new fusion proteins are functional for light-induced transcriptional activation. We further noticed that the expression level of the optogenetic regulator is crucial to obtain optimal functionality which encouraged us to develop a systematic characterization and optimization approach for finding optimal regulator expression levels for these and potentially also other cellular regulators. Our newly developed optogenetic proteins based on the T7RNAP and AraC, as well as lightinduced inactivation of chemicals, in particular inactivation of the inducer aTc, are all based on widely used transcription systems in E. coli and are therefore readily implementable into existing constructs and genetic circuits which either use aTc or wild-type T7RNAP or AraC. This makes these systems and an optogenetic implementation more attractive, especially when considering that light-application for induction of cellular samples is methodically not demanding. The newly developed light-inducible systems will also enable improved and completely new biotechnological and biomedical applications. Further, our strategy to create these regulators as well as the methods we developed for their optimization will facilitate future endeavors of implementing light-control into biological systems.
en_US
dc.description.abstract
Biologische Zellen und deren spezifische Zellfunktionen exakt zu regulieren ermöglicht es die Mechanismen des Lebens zu entschlüsseln. Die exakte Regulation bildet ebenso die Grundlage fortschrittlicher Biosysteme, welche verheissen biotechnologische Produktionsprozesse zu revolutionieren oder futuristische therapeutische Anwendungen zu ermöglichen. Licht wurde als vielversprechender Kommunikationskanal mit Zellen identifiziert, da es mit einer äusserst präzisen räumlichen und zeitlichen Auflösung appliziert werden kann. Beispielsweise ermöglicht der Einsatz von Licht, einzelne Zellen innerhalb einer Population oder Zellschicht anzusteuern und damit zu induzieren. Eine solche hochdynamische Kommunikation mittels Lichts ermöglicht Forschern Zellen mithilfe sogenannter “In-Silico-Feedback- Steuerungsstrategien”, also über computergesteuerte Lichtinduktion, zu vordefinierten Werten von verschiedensten messbaren Variablen zu steuern. Zellregulatoren, welche über Licht gesteuert werden, bilden die Basis dieses Kommunikationskanals, da sie die informationstragenden Lichtsignale in eine zelluläre Antwort umwandeln. Diese Dissertation beschreibt die De-novo-Entwicklung und Optimierung optogenetischer Systeme im Bakterium Escherichia coli. Obschon diese Regulatoren in E. coli entwickelt wurden, sind einige dieser Systeme und Methoden auch in anderen Organismen anwendbar. Einer der in dieser Arbeit entwickelten Transkriptionsregulatoren basiert auf der DNAabhängigen RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7 (Kapitel 2). Um diese Polymerase mit Licht kontrollierbar zu machen, haben wir inaktive Fragmente des Proteins mit Heterodimerisierungsdomänen, welche mit blauem Licht dimerisieren und somit aneinanderbinden, fusioniert und dabei mehrere neue Transkriptionsregulatoren geschaffen. Wir nannten diese Regulatoren, welche eine exzellente lichtgesteuerte Induzierbarkeit ihrer Transkriptionsaktivität vorweisen, “Opto-T7RNAPs”. Durch die Konzentration der Opto- T7RNAP selbst sowie über die Lichtintensität lässt sich die Genexpression dabei sehr fein einstellen. Ausserdem ermöglichen die lichtinduzierbaren Polymerasen schnelle Änderungen in der Stärke der Genexpression. Ferner sind Opto-T7RNAPs orthogonal zur zellulären Transkriptionsmaschinerie und damit nicht in zelluläre Regulationsmechanismen eingebunden. Wir haben eine dieser neu entwickelten lichtinduzierbaren Polymerasen ausgewählt, um die Eigenschaften des im Regulator enthaltenen Photosensors durch gerichtete Evolution zu optimieren. Photosensorische Domänen wie jene “Magnet”-Domänen, welche in der Opto-T7RNAP verwendet wurden, heterodimerisieren bei Lichtinduktion, wodurch das Split-Enzym aktiv wird. Unser lichtinduzierbares Genexpressionssystem macht es möglich, die Dimerisierung der lichtinduzierbaren Domäne, und damit ihre biologische Funktion, direkt in ein fluoreszierendes Signal umzuwandeln. Diese direkte Genotyp-Phänotyp-Verknüpfung diente als hervorragende Screening-Plattform für ein Teilprojekt dieser Arbeit, bei dem wir mehrere neue Varianten des Photosensors mit erhöhter Lichtempfindlichkeit und lichtinduzierten Dimerisierungseigenschaften identifizieren konnten (Kapitel 3). Des Weiteren stellten wir die Hypothese auf, dass für bestimmte klassische molekülinduzierte Genexpressionssysteme, welche seit Jahrzehnten zur “Kommunikation mit Zellen” eingesetzt werden, die Möglichkeit bestünde, auch diese für die Lichtkontrolle in biologischen Systemen zu verwenden. Diese Hypothese basierte auf dem Gedanken, dass die Absorption elektromagnetischer Wellen nicht nur strukturelle Veränderungen in lichtinduzierbaren Proteinen hervorruft, sondern auch zur Veränderung von lichtabsorbierenden Chemikalien führen kann. Dies nutzt man zum Beispiel zur Entgiftung von Abwässern von Tetracyclin- Antibiotika, welche durch Licht in biologisch inaktive Substanzen abgebaut werden. Auf diesen Erkenntnissen aufbauend haben wir eine Methode entwickelt, mit der durch lichtabhängige Inaktivierung des Transkriptionsinduktors Anhydrotetracyclin (aTc) die Genexpression reguliert werden kann. Diese Herangehensweise liess sich auch auf die Inaktivierung des bakteriostatischen Antibiotikums Tetracyclin für lichtgesteuertes Bakterienwachstum übertragen (Kapitel 4). Diese Methode beruht auf der Lichtempfindlichkeit dieser beiden Moleküle und wir konnten diese Eigenschaft dazu nutzen, um diese Moleküle mittels UVA-Lichts präzise zu inaktivieren. Ein äusserst relevanter Vorteil der lichtgesteuerten aTc-Inaktivierung besteht darin, dass sie in allen Zellen angewendet werden kann, welche bestimmte Prozesse über das Induktormolekül aTc steuern - sei es das TetR-Repressorprotein oder andere aTc-bindende Derivate davon. Dies bedeutet, dass die Methode ohne weitere genetische Manipulation in vielen Bakterienstämmen und Zelllinien lichtgesteuerte Experimente ermöglicht. Zusätzlich erlaubt dieses Verfahren, den Sollwert für die Stärke der Genexpression durch Zugabe des Induktormoleküls oder dessen lichtvermittelte Inaktivierung zu erhöhen oder zu verringern. So eine “Sollwertsfixierung” ist einzigartig im Vergleich zu anderen Ansätzen, welche zur Lichtsteuerung von Zellen verwendet werden. Photoaktivierbare Moleküle sind beispielsweise ausschliesslich aktivierbar, können allerdings nach einer Aktivierung nicht mehr inaktiviert werden. Lichtinduzierbare Proteine sind wiederum nur zum Zeitpunkt der Lichtaktivierung aktiv, und begeben sich ohne Licht mit unterschiedlicher Kinetik unweigerlich wieder in ihren inaktiven Grundzustand. Unsere Methode unterscheidet sich hier substanziell, da die funktionalen, lichtsensiblen Moleküle zu einer Probe zugegeben werden, in der diese dann aktiv sind, bis sie per Licht inaktiviert werden. Ihre “Sollaktivität” verändert sich somit nicht, sofern keine weiteren Moleküle hinzugefügt werden oder Licht die Probe erreicht. In einer Anwendung dieses Mechanismus in dieser Arbeit zeigen wir, wie über die Zugabe solcher Moleküle oder über deren lichtgesteuerte Inaktivierung gezielt bestimmte Sollwerte von Genexpressionsstärken erreicht werden können. Zudem kombinierten wir eines unserer Opto-T7RNAP mit einer aTc-gesteuerten Repression der Opto-T7RNAP-Komponenten, um eine zweiteilige optogenetische Kontrolle zu erreichen. Dies ermöglichte es, die Restaktivität der Opto-T7RNAP im Dunkeln zu reduzieren, während die lichtinduzierte Aktivität nicht verändert wurde, wodurch sich der Operationsbereich der Genexpressionsstärke des Regulators deutlich vergrösserte. Um zu zeigen, dass diese Methode der lichtgesteuerten Inaktivierung von Molekülen nicht nur auf das Molekül aTc beschränkt ist, sondern auch auf andere lichtempfindliche Moleküle angewendet werden kann, demonstrierten wir denselben Effekt mit dem Antibiotikum Tetracyclin. Wir verwendeten es, um das Wachstum einer Bakterienkultur zu stoppen und dann das Wachstum dieser Kulturen durch lichtvermittelte Inaktivierung des Antibiotikums gezielt wieder zu ermöglichen. Weiter haben wir TetR, welches die Induktion von Genexpression in Gegenwart von aTc ermöglicht, mit einer veränderten TetR-Variante namens “rTetR” kombiniert, die eine umgekehrte Funktionalität zeigt, also Genexpression nur ermöglicht, wenn kein aTc in der Zelle ist. Dies erlaubte es uns, einen chemischen Bandpassfilter zu kreieren, der das Anwendungspotential von aTc als Induktor sowie auch unserer Methode der lichtvermittelten Inaktivierung von aTc, weiter ausbauen wird. Schließlich haben wir in dieser Arbeit den ersten endogenen lichtinduzierbaren Transkriptionsaktivator in E. coli entwickelt (Kapitel 5). Als Grundlage hierfür verwendeten wir die DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomäne des endogenen Transkriptionsfaktors AraC und kombinierten diese mit lichtinduzierbaren Homodimerisierungsdomänen, um eine durch Blaulicht induzierbare AraC-Dimerisierung (BLADE), und damit deren Aktivierung, zu erreichen. Wir zeigten, dass beide Konformationen mit der AraC-Domäne entweder am N- oder am C-Terminus der neuen Fusionsproteine zur lichtinduzierten Transkriptionsaktivierung fähig sind. Wir haben ferner festgestellt, dass das Expressionsniveau des optogenetischen Regulators für dessen Funktionalität entscheidend ist, was uns dazu brachte, einen systematischen Charakterisierungs- und Optimierungsansatz zu entwickeln, der es ermöglicht, optimale Regulator-Expressionsniveaus für diese und möglicherweise auch andere zelluläre Regulatoren zu finden. Unsere neu entwickelten optogenetischen Proteine auf Basis der T7RNAP und dem Transkriptionsfaktor AraC sowie das Konzept der lichtgesteuerten Inaktivierung von Chemikalien, insbesondere die Inaktivierung des Induktors aTc, basieren alle auf weit verbreiteten Transkriptionssystemen in E. coli. Sie sind daher nicht nur für neue Bakterienstämme und Zelllinien interessant, sondern sehr einfach auch in bestehende genetische Konstrukte anwendbar, die bereits aTc, Wildtyp-T7RNAP oder AraC verwenden. Dies macht die hier entwickelten Systeme und die Verwendung von Licht als Kommunikationskanal zu biologischen Systemen äusserst attraktiv, insbesondere wenn man bedenkt, dass die Methodik für solche Anwendungen, also die «Applikation» von Licht, äusserst einfach zu implementieren ist. Die in dieser Arbeit und durch die Arbeit von anderen Gruppen neu entwickelten lichtinduzierbaren Systeme werden verbesserte und völlig neue biotechnologische und biomedizinische Anwendungen ermöglichen. Die Erkenntnisse die wir während unseres Forschungsprozesses gewinnen konnten, sowie die Methoden die wir entwickelten, werden auch künftige Bemühungen zur Steuerung weiterer biologischer Systeme mittels Lichts wesentlich erleichtern.
en_US
dc.format
application/pdf
en_US
dc.language.iso
en
en_US
dc.publisher
ETH Zurich
en_US
dc.rights.uri
http://rightsstatements.org/page/InC-NC/1.0/
dc.subject
Bioengineering
en_US
dc.subject
Optogenetics
en_US
dc.subject
Synthetic Biology
en_US
dc.subject
Protein engineering
en_US
dc.subject
Enzyme engineering
en_US
dc.subject
Directed Evolution
en_US
dc.subject
Transcriptional regulation
en_US
dc.title
Design and Optimization of Novel Optogenetic Regulators
en_US
dc.type
Doctoral Thesis
dc.rights.license
In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
dc.date.published
2021-03-30
ethz.size
318 p.
en_US
ethz.code.ddc
DDC - DDC::5 - Science::500 - Natural sciences
en_US
ethz.identifier.diss
26931
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ethz.publication.place
Zurich
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ethz.publication.status
published
en_US
ethz.leitzahl
ETH Zürich::00002 - ETH Zürich::00012 - Lehre und Forschung::00007 - Departemente::02060 - Dep. Biosysteme / Dep. of Biosystems Science and Eng.::03921 - Khammash, Mustafa / Khammash, Mustafa
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ethz.date.deposited
2021-03-29T20:19:46Z
ethz.source
FORM
ethz.eth
yes
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ethz.availability
Open access
ethz.date.embargoend
2024-03-30
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2021-03-30T06:58:33Z
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2024-02-02T13:25:11Z
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