Study of the physiological impact of early life trauma from multiomics to reproductive biology

Abstract

In many species, environmental factors and life experiences can change the phenotypic traits of exposed individuals and their progeny. Traumatic stress is a type of environmental experience that can modify behavior, cognition and physiological functions such as metabolism, in mammals. Many of the effects of traumatic stress can be transmitted to subsequent generations even when individuals from these generations are not exposed to any traumatic stressor. Such environmentally-induced effects are an important mode of trait transmission across generation, which involve factors in the germline other than the genetic code. In rodents, where most of the work on epigenetic inheritance is conducted, the limited amount of sperm per male poses constraints on downstream analyses. The challenge, therefore, is the possibility to analyze DNA and RNA, and produce offspring from the sperm of a single male. To solve these challenges, we established an experimental strategy called OmniSperm that enabled simultaneous multiomic analyses and artificial insemination with a single-male sperm sample. To enable this, we improved the sperm collection method increasing the yield from a single male mouse from around 5 million sperm cells to 40 million sperm cells. We applied this approach to profile the DNA methylome and transcriptome of a father’s sperm and related them to the transcriptome of the offspring generated from the same sperm. We also validate the method using a mouse model of transgenerational transmission of early life trauma, demonstrating the method’s capability to examine the transcriptome dynamics between sperm and the resulting embryos. Although our data sets limited us to correlative comparisons, we were able to relate a potential interplay between DNA methylation at regulatory regions and their resulting transcriptome. In particular, we identified a potential trauma-induced dysregulation of transcription factors, that may drive changes in the developing embryo, such as Clock (circadian TF) and the trans-acting TFs (Sp) 1, 2 and 3. These transcription factors are important mediators of selective gene activation in spermatogenesis and were shown to be essential for mouse development. During the development of OmniSperm, we identified the extraction of high-quality RNA from sperm to be a particularly challenging step in investigating molecular mechanisms of epigenetic inheritance. Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (AGPC) is a widely used and efficient method to obtain pure RNA from most tissues and cells. However, we found that it was not efficient in lysing sperm cells because they are resistant to chaotropic lysis solutions containing guanidinium thiocyanate such as Buffer RLT+ and Trizol. We showed that disulfide bonds play an important role in conveying chemical resistance of sperm cells. These lysis issues were overcome by using tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) as an efficient lysis enhancer of AGPC solutions that can retain reducing activity even at acidic pH. Trizol supplemented with TCEP allows the complete and rapid lysis of sperm cells, increasing RNA yield by 100-fold and resulting in RNA with optimal quality for reverse transcription and polymerase chain reaction. In parallel to investigating the effects of early life trauma on the male germ line, we also studied the immediate and long-term impact on metabolism and various tissues in the mothers, their young pups and adult offspring. Mothers milk is the main source of nutrients for infants and has been shown to modulate offspring’s development, physiology and behaviour. We examined the impact of traumatic stress on the mother’s milk and the offspring’s physiology. The collection of mouse milk is challenging and typically yielded only little milk. Therefore, we first established a new method, wherein mammary glands were excised and the milk retrieved through centrifugation. We found altered miRNAs in mammary gland milk and partially digested milk collected from pups’ stomachs. Similarly, metabolomics analysis of maternal milk showed widespread dysregulation of milk macronutrients and metabolites. We compared the altered metabolite networks and identified enriched pathways for AGE-RAGE signaling, and protein digestion and absorption. These changes were validated by targeted amino acid analysis and found evidence trauma-induced metabolome and miRNA expression changes in the dams and their offspring, with potential metabolic and immunological consequences for the developing pups. Finally, we investigated whether bones were affected by early life trauma. Bone pathology was previously reported to occur frequently in stressed individuals and a comprehensive examination of mechanisms linking life stress, depression and disturbed bone homeostasis was missing. In a translational study, mice exposed to early life trauma were found to exhibit altered gene expression, higher innervation density in bones and increased catabolic bone turnover. Depressive study participants which experienced childhood neglect also showed disturbed bone homeostasis and their bone density was reduced. In summary, the work in this thesis investigated the immediate and long-term consequences of early life trauma on various tissues in mice. Methods were improved or new ones established to provide sufficient starting material for multiple types of molecular analyses.

Umweltfaktoren und Lebensereignisse können in zahlreichen Spezies zu phänotypischen Veränderungen in den betroffenen Individuen und deren Nachkommen führen. Traumatischer Stress ist eine Art von Umweltfaktor welcher in Säugetieren das Verhalten und physiologische Funktionen, wie zum Beispiel den Metabolismus, verändern kann. Die Folgen von traumatischem Stress können auch an die nachfolgende Generation vererbt werden. Dazu müssen die Nachkommen selbst nicht direkt dem traumatischen Stress ausgesetzt gewesen sein. Solche durch die Umwelt ausgelösten Vererbungseffekte sind ein wichtiger Modus, um bestimmte Merkmale an die nachfolgende Generation zu vererben, ohne dabei das genetische Erbgut an sich zu verändern. Diese Form der epigenetischen Vererbung wird vor allem in Nagetieren wie z.B. Mäusen untersucht. Allerdings ist die Untersuchung von epigenetischer Vererbung in Mäusen schwierig, weil nur wenige Spermienzellen eingesammelt werden können. Eine zu lösende Herausforderung war deshalb genügend Spermienzellen von einer männlichen Maus einzusammeln, um einerseits Nachkommen zu zeugen und andererseits molekulare Analysen an der Desoxyribonukleinsäure (DNA) sowie der Ribonukleinsäure (RNA) durchzuführen. Um diese Einschränkungen zu lösen, haben wir eine neue experimentelle Strategie namens OmniSperm etabliert. Diese erlaubt mehrere Omics-analysen sowie künstliche Insemination mit einer Spermienprobe von einem einzelnen Männchen durchzuführen. Wir haben dazu die Art und Weise der Spermieneinsammlung verbessert. Dadurch konnten wir die Anzahl gesammelter Spermien von 5 Million auf 40 Millionen pro Maus verbessern. Wir verwenden die OmniSperm Strategie um in den Spermien die DNA-Methylierung und deren Transkriptom (die Gesamtheit aller RNAs) zu untersuchen. Ferner konnten wir diese Eigenschaften dann auch direkt mit den resultierenden Embryonen vergleichen, weil die Embryonen von den gleichen Spermien gezeugt wurden. Diesen Ansatz haben wir validiert mittels eines etablierten Models der transgenerationalen Vererbung der Effekte von traumatischem Stress. Obwohl unsere Datensätze nur Korrelationen erlauben, konnten wir potenzielle Interaktionen erkennen zwischen der veränderten DNA-Methylierung und regulatorischen Regionen der DNA, sowie dem daraus resultierenden Transkriptom. Wir identifizierten Veränderungen von Transkriptionsfaktoren (TF), welche durch das Trauma ausgelöst wurden, und die vermutlichen Veränderungen im sich entwickelnden Embryo hervorrufen können, wie zum Beispiel: Clock (ein zirkadianischer TF) und die in trans agierenden TF (Sp) 1, 2 und 3. Diese Transkriptionsfaktoren sind wichtige Modulatoren von gezielter Geneaktivierung in der Produktion von Spermien und essenziell für die Entwicklung von Mäusen. Während der Entwicklung von der OmniSperm Strategie waren wir mit einer weiteren Herausforderung konfrontiert: Die Extraktion von RNAs aus Mausspermien war anders als erwartet nicht effektiv. Die typische RNA-Extraktionsmethode verwendet eine Mischung von Phenol, Chloroform und Guanidiniumthiocyanat (engl. Abk. AGPC) um Zellen aufzubrechen und anschliessend reine RNA von guter Qualität zu extrahieren. Allerdings stellte sich heraus, dass die Spermienzellen nicht effektiv aufgebrochen werden können durch AGPC und sie auch anderen chaotropischen Lyse-Puffern wie z.B. «Buffer RLT+» oder «Trizol» widerstehen. Wir konnten zeigen, dass die Disulfidbrücken eine wichtige Rolle bei dieser Art der chemischen Widerstandsfähigkeit der Spermienzellen spielen. Die Lyse konnten unter Zugabe von tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) deutlich verbessert werden, weil TCEP auch bei niedrigem pH wirkt. Eine Mischung aus Trizol und TCEP löste Spermienzellen rasch und komplett auf. Dies erhöhte die Menge an RNA um das Hundertfache, welche anschliessend für Reverse Transkription und Polymerase-Kettenreaktion verwenden werden konnte. Parallel zu unseren Untersuchungen in der Keimbahn von Männchen haben wir auch die Langzeitfolgen für den Metabolismus und diverse Gewebe der Mutter, deren junge und erwachsene Nachkommen näher untersucht. Die Milch der Mütter ist die Hauptquelle von Nährstoffen für Säuglinge und frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Milch die Entwicklung, Physiologie und das Verhalten von Nachkommen beeinflussen kann. Wir untersuchten die Effekte von traumatischem Stress auf die Milch von Mäusen und deren Nachkommen. Wir stellten fest, dass das Einsammeln von Mausmilch mit bisherigen Methoden schwierig war und typischerweise nur wenig Milch resultierte. Wir haben deshalb einen anderen Ansatz etabliert, bei dem das Brustgewebe entfernt und dich Milch anschliessend mittels Zentrifugation eingesammelt werden konnte. Wir beobachteten, dass in der mütterlichen Milch und der Milch aus den Mägen der Jungtiere mehrere regulatorische Micro-RNAs (miRNA) aufgrund des traumatischen Stresses verändert waren. Ferner wurden die Metaboliten der Milch analysiert und es zeigte sich, dass zahlreiche Makronährstoffe und Metaboliten verändert waren. Wir verglichen die veränderten Metaboliten Netzwerke mit bereits publizierten Daten aus dem Blut der Jungtiere und identifizierten biochemische Reaktionswege für die Signalkaskade «AGE-RAGE» sowie Proteinverdauung und Proteinabsorption. Diese Veränderungen konnten wir mittels gezielter Analyse von Aminosäuren im Blut der Jungtiere bestätigen. Die Veränderungen der miRNAs und Metaboliten in der mütterlichen Milch sowie dem Blut der Nachkommen deuteten auf mögliche Konsequenzen für den entwickelnden Organismus hin. Zuletzt untersuchten wir ob traumatischer Stress sich auf die Knochen auswirkt. Diverse Knochenpathologien treten häufiger in chronisch gestressten Individuen auf. Allerdings fehlte bisher eine umfassende Untersuchung, die Stress und Depression mit einer veränderten Knochenhomöostase in Verbindung bringen. In unserem Studienansatz untersuchten wir, wie sich traumatischer Stress im frühkindlichen Alter auswirken kann. Wir fanden veränderte Genexpression und höhere Nervendichte in den Knochen, sowie eine erhöhte Rate der Knochenerneuerung. Bei depressiven Studienteilnehmer, welche als Kinder vernachlässigt wurden, fanden wir ebenfalls Anzeichen für eine gestörte Knochenhomöostase und geringere Knochendichte. Zusammenfassen, haben wir in dieser Doktorarbeit die unmittelbaren und lebenslangen Konsequenzen von frühkindlichem, traumatischem Stress in verschieden Organen, Geweben und Zellen untersucht und dabei zahlreiche Veränderungen festgestellt. Mehrere Methoden wurden entweder verbessert oder neu etabliert, um genügend Material für mehrere Arten von molekularen Analysen durchführen zu können.