Continuity During Embryonic Diapause in the European Roe Deer (Capreolus Capreolus)

Abstract

Embryonic diapause in mammals describes a transitional reduction of proliferation and developmental progression occurring at the blastocyst stage. Descriptions of this form of delayed implantation occurring in the European roe deer (Capreolus capreolus) date back to the 19th century, and since then diapause has been discovered in over 130 mammalian species across different orders. Hitherto, the roe deer remains the only ungulate species known to display diapause and the molecular mechanisms of diapause in the roe deer are yet to be elucidated. Successful implantation requires a tight communication between the developing embryo and the endometrium to enable the coordination of maternal and embryonic processes. During diapause, these processes take place at a slower pace allowing a gradual syn- chronization of maternal and embryonic cues. In the roe deer, only few endometrial changes are known to occur. One of these changes is a gradual reduction of luminar epithelial cell height. Based on similarities to other spe- cies, these changes in cell morphology may be linked to co-occurring modifications of the cytoskeleton as well as the surrounding extracellular matrix (ECM). We employed an im- munohistochemical approach to gain insights into changes in the distribution of ECM components between early, late, and post-diapause uteri. While our findings confirmed the reduction of epithelial cell height, the selected ECM factors displayed only marginal changes in estimated quantity and localization. Major ECM remodelling events are there- fore unlikely to occur prior to implantation. While the endometrium during diapause appears relatively static, the roe deer blastocyst continuously grows during diapause. It was unclear whether this growth occurred due to an increase in blastocoel volume accompanied by an increase in cell size or due to active proliferation. Furthermore, it remained to be clarified whether this growth was restricted to the trophectoderm (TE) or was accompanied by growth of the inner cell mass (ICM). We assessed the expression of the proliferation marker KI67 by immunofluorescence and nuclear staining and imaged the stained blastocysts using light sheet microscopy. Thereby, we found that the number of total nuclei increased almost 100-fold between September and December. The relative increase of nuclei in the ICM was only slightly lower than in the TE, whereas the fraction of Ki67 positive cells appeared lower in the TE. iii We hypothesize that this could be explained by differences in the duration of individual cell cycle phases, with TE cell having a shorter G1 phase. In addition to proliferation, we also detected considerable morphological changes, indic- ative of ongoing differentiation and thus development within the ICM. While RNA-Seq data of embryos spanning the period of diapause and elongation was available, the first version of the roe deer transcriptome lacked annotations for a significant proportion of potential developmental marker genes. To assess developmental progression during di- apause in the roe deer, we thus developed an alternative assembly and annotation strat- egy and localized a selection of molecular markers using immunofluorescence. We con- firmed that endoderm formation occurs during diapause, while gastrulation and neurula- tion likely only occur upon elongation. The morphological changes within the ICM were reflected by correlating gene expression patterns, indicating that in the roe deer develop- mental processes are not halted during diapause. Our studies demonstrate that while the endometrial ECM remains unchanged, the em- bryo slowly continues to proliferate and to develop. The elements that regulate this drastic reduction of developmental pace and whether the embryonic development indeed occurs fully independent of maternal signalling cues remains to be elucidated.

Die embryonale Diapause bei Säugetieren beschreibt eine vorübergehende Verringerung der Proliferation und des Entwicklungsfortschritts, welche im Blastozystenstadium auftritt. Die ersten Beschreibungen dieser Art der Implantationsverzögerung im europäischen Reh (Capreolus capreolus) gehen bis ins 19. Jahrhundert zurück und wurde seit dem in über 130 Säugetierarten aus verschiedenen Ordnungen nachgewiesen. Das Reh ist bis heute die einzige Huftierart, bei welcher eine Diapause nachgewiesen wurde und die molekularen Mechanismen der Diapause im Reh sind nach wie vor unklar. Eine erfolgreiche Implantation beruht auf der Koordination von mütterlichen und embryo- nalen Prozessen und erfordert somit eine enge Kommunikation zwischen dem sich ent- wickelnden Embryo und dem Endometrium. Während der Diapause laufen diese Pro- zesse ab, was eine allmähliche Synchronisation von mütterlichen und embryonalen Sig- nalen ermöglicht. Beim Reh sind jedoch nur wenige Veränderungen im Endometrium während der Dia- pause bekannt. Eine dieser Veränderungen ist die Reduktion der Epithelzellhöhe. Auf Grund von Ähnlichkeiten zu anderen Spezies, könnten solche Veränderungen der Zell- morphologie mit gleichzeitig auftretenden Modifikationen des Zytoskeletts sowie der um- gebenden extrazellulären Matrix (ECM) in Verbindung stehen. Mithilfe der Immunhisto- chemie haben wir Einblicke in die Verteilung von ECM-Komponenten in Uteri von Rehen während der frühen und späten, sowie nach der Diapause gewonnen. Während unsere Ergebnisse die Verringerung der Epithelzellhöhe bestätigten, wiesen die ausgewählten ECM-Faktoren bezüglich der geschätzten Proteinmenge und ihrer Lokalisierung nur mar- ginale Veränderungen auf. Es ist daher unwahrscheinlich, dass größere Rekonstrukti- onsprozesse der ECM vor der Implantation stattfinden. Obwohl das Endometrium während der Diapause relativ statisch scheint, wächst die Blastozyste des Rehs während der Diapause kontinuierlich. Es war unklar, ob dieses Wachstum aufgrund eines Anstieges des Blastocoelvolumens und einer Zunahme der Zellgröße, oder aufgrund von aktiver Proliferation auftritt. Weiterhin blieb zu klären, ob dieses Wachstum auf das Trophektoderm (TE) beschränkt war oder ob auch die inneren Zellmasse (ICM) in dieser Zeit wächst. Wir haben die Expression des Proliferationsmar- kers KI67 mittels Immunfluoreszenz und Kernfärbung bestimmt und die gefärbten Blasto- zysten mittels „Light-Sheet“-Mikroskopie abgebildet. Dabei stellten wir fest, dass die An- zahl der Gesamtkerne zwischen September und Dezember fast 100-fach anstieg. Die v relative Zellkernzunahme war in der ICM nur geringfügig geringer als im TE, während der Anteil an Ki67-positiven Zellen im TE geringer erschien. Wir vermuten, dass dies durch Unterschiede in der Dauer der einzelnen Zellzyklusphasen erklärt werden könnte, wobei TE-Zellen im Vergleich zu ICM-Zellen eine kürzere G1-Phase aufweisen würden. Neben der Proliferation stellten wir auch erhebliche morphologische Veränderungen in- nerhalb der ICM fest, die auf eine fortschreitende Differenzierung und damit Entwicklung hindeuten. Obwohl bereits RNA-Seq-Daten von Embryonen während Diapause und Elongation verfügbar waren, fehlten in der ersten Version des Reh-Transkriptoms die An- notationen eines signifikanten Anteils potenzieller Marker-Gene der Embryonalentwick- lung. Um den Entwicklungsfortschritt während der Diapause beim Reh zu beurteilen, ha- ben wir daher eine alternative Assembly- und Annotationsstrategie entwickelt, sowie eine Auswahl von molekularen Markern mittels Immunfluoreszenz lokalisiert. Wir konnten be- stätigen, dass die Bildung des Endoderms während der Diapause erfolgt, während die Gastrulation und die Neurulation wahrscheinlich erst während der Elongation auftreten. Die morphologischen Veränderungen in der ICM wurden dabei in korrelierenden Genex- pressionsmustern widergespiegelt, was darauf hindeutet, dass Entwicklungsprozesse beim Reh während der Diapause fortlaufen und nicht angehalten werden. Unsere Studien zeigen, dass, die endometriale ECM unverändert bleibt, während der Embryo langsam weiter proliferiert und sich entwickelt. Künftige Studien werden darüber Aufschluss geben, welche Elemente diese drastische Verringerung des Entwicklungs- tempos regulieren und ob die embryonale Entwicklung tatsächlich völlig unabhängig von mütterlichen Signalen erfolgt.