Design and evaluation of synthetic gene circuit elements for the classification of cellular senescence

Abstract

Chronological ageing represents the greatest risk factor for most chronic diseases and is also directly linked to physiological decline in humans. This implies that the processes which progressively drive ageing must promote the diseases associated with it. As life expectancy increases in the modern world, so can we expect an upsurge in the number of age-related diseases. Cellular senescence is considered one of the nine hallmarks of ageing, and the accumulation of senescent cells in organs and tissues with age is known to disrupt tissue function and drive many diseases of ageing. Strategies to eliminate, impair, or reprogram senescent cells have shown great potential in improving overall health and lifespan. However, many of these therapies that target senescence have relied on a single biomarker and thus lack specificity, which can cause off-target effects. The field of synthetic biology has consistently developed in the past few decades and now describes many novel ways to manipulate the biology of cells, perform computations with biological components, and classify particular cell types. In this study, I leveraged synthetic biology components to design a gene circuit to classify senescent cells based on the three characteristics common to most senescent cells: cell cycle arrest, a bioactive secretome, and apoptosis resistance. To deliver this circuit to non-dividing senescent cells, I first assessed and then optimised the common self-inactivating lentiviral vector for the delivery of my gene circuit elements to cells. To build the three sensor parts of this gene circuit, I used RNA-sequencing (RNA-seq) and miRNA sequencing (miRNA-seq) to identify potential sensor inputs. From RNA-seq data, I devised a systematic workflow to construct and test promoter-based state sensors that should recapitulate gene expression behaviour. This yielded a sensor for cell cycle arrest but not for the other two senescence features. I then leveraged the optimised lentiviral vector to develop a platform for faithfully testing miRNA-based sensors in virus-transduced cells. With this done, I used the platform to assess a panel of miRNAs chosen from miRNA-seq data and identified a senescence-specific miRNA linked to apoptosis resistance. The results of this research provide an enhanced method of delivering gene circuit elements to non-dividing cells and identify two of the three markers necessary to construct a synthetic classifier gene circuit that can specifically identify senescent cells.

Das chronologische Altern ist der größte Risikofaktor für die meisten chronischen Erkrankungen und steht zudem in direktem Zusammenhang mit dem physiologischen Abbau beim Menschen. Dies bedeutet, dass die Mechanismen, die den Alterungsprozess antreiben, gleichzeitig auch zur Entstehung der damit verbundenen Krankheiten beitragen. Mit steigender Lebenserwartung in der modernen Welt ist somit auch mit einer Zunahme altersbedingter Krankheiten zu rechnen. Die zelluläre Seneszenz gilt als eines der neun Kennzeichen des Alterns, und die Anhäufung seneszenter Zellen in Organen und Geweben mit zunehmendem Alter stört nachweislich die Gewebefunktion und befördert zahlreiche altersbedingte Krankheiten. Strategien zur Beseitigung, Beeinträchtigung oder Umprogrammierung seneszenter Zellen haben bereits ein großes Potenzial bewiesen, zur Verbesserung der allgemeinen Gesundheit sowie der Lebenserwartung beizutragen. Viele Therapien, die auf Seneszenz abzielen, beruhen jedoch auf einem einzigen Biomarker und weisen daher eine unzureichende Spezifität auf, was zu Off-Target-Effekten führen kann. Das Gebiet der synthetischen Biologie hat sich in den letzten Jahrzehnten stetig weiterentwickelt und bietet heute viele neue Möglichkeiten, die Biologie von Zellen zu manipulieren, Berechnungen mit biologischen Komponenten durchzuführen sowie bestimmte Zelltypen zu klassifizieren. In dieser Studie habe ich Komponenten der synthetischen Biologie genutzt, um einen Genschaltkreis zur Klassifizierung seneszenter Zellen zu entwickeln, der auf den drei Merkmalen basiert, die den meisten seneszenten Zellen gemein sind: Zellzyklus-Stillstand, ein bioaktives Sekretom und Apoptoseresistenz. Um diesen Schaltkreis in sich nicht teilende seneszente Zellen einzubringen, habe ich zunächst den gängigen selbst-inaktivierenden lentiviralen Vektor für die Integration meiner Genschaltkreiselemente in die Zellen evaluiert und anschließend optimiert. Für die Entwicklung der drei Sensorteile dieses Genschaltkreises nutzte ich RNA-Sequenzierung (RNA-seq) und miRNA-Sequenzierung (miRNA-seq), welche es mir ermöglichten potenzielle Sensor-Inputs zu identifizieren. Ausgehend von den RNA-seq-Daten habe ich ein systematisches Verfahren entwickelt, um promotorbasierte Zustandssensoren zu konstruieren und zu testen, die das Genexpressionsverhalten nachahmen sollen. Dies lieferte einen Sensor für den Zellzyklus-Stillstand, jedoch nicht für die beiden anderen Merkmale der Seneszenz. Anschließend nutzte ich den optimierten lentiviralen Vektor, um eine Plattform zu entwickeln, mit der sich miRNA-basierte Sensoren in virus-transduzierten Zellen zuverlässig testen lassen. Mit Hilfe dieser Plattform habe ich ein Panel von miRNAs, V ausgewählt basierend auf den miRNA-seq-Daten, untersucht und eine seneszenz-spezifische miRNA identifiziert, die mit Apoptoseresistenz in Verbindung steht. Die Ergebnisse dieser Forschung bieten eine verbesserte Methode zur Einbringung von Genschaltkreiselementen in sich nicht teilende Zellen und identifizieren zwei der drei Marker, die für den Aufbau eines synthetischen Klassifizierungsgenschaltkreises erforderlich sind, der seneszente Zellen spezifisch identifizieren kann.